Metody detekce bodových polymorfismů (SNP)

Detekce bodových polymorfismů je nezbytnou součástí každé asociační studie, proto je výběr adekvátní metodiky velmi důležitý. Ideální detekční metoda by měla splňovat tyto podmínky:

  1. zpracování vzorků by mělo být rychlé a jednoduché
  2. cena za vzorek by měla být co nejnižší a měla by být co nejméně náročná na čas potřebný k její optimalizaci
  3. reakce by měla být stabilní a dostatečně silná, aby zachytila i vzorky lehce odlišné od optima
  4. metoda by měla jít automatizovat a měla by být co nejméně náročná na zásah obsluhy
  5. analýza dat by měla být jednoduchá, automatizovaná, spolehlivá
  6. měla by být pružná s širokou škálou, schopna pojmout stovky až miliony vzorků za den
  7. jednou optimalizovaná metoda by měla snížit cenu stanovení vzorku na genotyp (včetně zařízení, reagencií a obsluhy).

Dodnes taková metoda neexistuje. Snad další vývoj v oblasti biochemie a analytického softwaru přinese metodu, která bude splňovat výše uvedené podmínky a bude vhodná pro měření všech dostupných vzorků.

Způsob zpracování vzorku

Před vlastní genotypizací DNA je zapotřebí každý vzorek připravit pro patřičnou metodu. Jedná se o několik kroků, nutných k visualizaci nebo k jejímu zesílení. Obecně lze říci, že všechny biochemické reakce mají odlišný průběh pokud probíhají v roztoku nebo na pevném nosiči. V zásadě lze rozdělit způsob zpracování na homogenní reakce (homogeneous reaction) a reakce na pevném nosiči (solid phase reaction).

Rozlišení alel

SNPs lze detekovat buďto způsobem závislým na sekvenci nebo způsobem na sekvenci nezávislým. Sekvenčně nezávislý způsob detekce je založen na zachycení, odštěpení nebo změnách pohyblivosti během elektroforézy (nebo kapalné chromatografie) odlišných heteroduplexů z předchozí denaturace. Aškoli jsou sekvenčně nezávislé metody detekce polymorfismů velmi užitečné ve výzkumu polymorfizmů a mutací, nejsou použitelné při genotypizaci, protože nikdy nevíme, zda-li je zjištěný genotyp ten hledaný. Sekvenčně specifický způsob detekce je založen na 4 obecných molekulárních mechanismech:

  1. Hybridizace specifických alel
  2. Prolongace primerů
  3. Vazba oligonukleotidů specifických alel
  4. Sekvenování

Detekční mechanismy

K detekci rozdílných alel se většinou využívá vyzařování světla specifickými produkty (s navázanými značkami), měření hmotnosti konečného produktu nebo změna elektrického náboje produktu. Obecně lze říci, že ke genotypizaci je zapotřebí pouze jediná značící složka, pokud je výsledkem dostatečně oddělený a čistý produkt. Při homogenních reakcích není zapotřebí produkty oddělovat, jejich vlastnosti jsou během reakce změněny natolik, ža se dají snadno detekovat. Genotypizační metody využívají různých fyzikálních vlastností značek jako je: detekce záření (nejpoužívanější), hmotnostní spektrofotometrie, změna elektrického náboje. Detekce záření se dále dělí na luminiscenci, fluorescenci, FRET (fluorescence resonance energy transfer), FP (fluorescence polarization), a další. Pro metody založené na detekci světla je k dispozici ohromná škála značících složek s různými vlastnostmi co se týče emise světla.

Principy detekce SNP

Hybridizace specifických alel

Také známá jako ASO (allele specific oligonucleotide hybridization). Tato metoda je založena na rozlišení mezi dvěma DNA molekulami lišících se jednou bazí po hybridizaci. Fluorescenčně značené PCR fragmenty jsou použity k označení oligonukleotidů představujících SNP sekvence. Po hybridizaci a promytí se měří intenzita fluorescence pro každý SNP oligonukleotid.

Prolongace primerů

Zaměřená na změnu jedné baze. Cílová oblast je amplifikována pomocí PCR, následuje reakce mezi jednotlivými bazemi a primerem uvolňujícím baze z polymorfního místa. Bylo popsáno několik metod, v některých jsou značeny primery a produkty jsou vázány na elektroforetický gel, některé metody štěpí produkt na menší DNA fragmenty, které pak měří hmotnostní spektrofotometrií. Nejoblíbenější metoda zahrnuje fluorescenční značku, která zastavuje řetězovou reakci.

Vazba oligonukleotidů na specifické alely

Když přidáme 2 spojené oligonukleotidy k templátové DNA, naváží se na ni jen v případě, že jsou perfetně komplementární k templátové DNA. Výhoda tohoto mechanismu je v jeho specifitě a nezávislosti na předchozí amplifikaci PCR, nevýhodou však zůstává příliš pomalá reakce a nároky na velké množství upravených prób.

Sekvenování

Sekvenování se využívá zejména při výzkumu SNP. Nejčastější způsoby sekvenování je založena na prolongaci primerů a využívají:

  1. primery značené barvičkou a neznačené terminátory (zastavují reakci)
  2. neznačené primery a značené terminátory
Produkty reakce jsou poté odděleny prostřednictvím elektroforézy.





Základní literatura: Laboratorní manuály online: Další informace v podkategorii Užitečné odkazy