Atopická onemocnění typu astma bronchiale, alergické rýmy a atopické deramatitidy se řadí mezi tzv. civilizační choroby, na jejichž vzniku se podílí jak faktory genetické, tak i vlivy zevního prostředí. Podle epidemiologických studií výskyt alergických nemocí neustále stoupá u dětí i dospělých. Novější práce přisuzují cytokinu IL-18 důležitou roli v rozvoji atopichkých onemocnění. Cílem projektu je zhodnotit možný význam polymorfizmu v genu pro IL-18 v etiopatogeneze atopického astmatu, alergické rýmy a případně atopické dermatitidy a dále posoudit účast jednotlivých genových variant či jejich kombinací na vyjádření fenotypových markerů (intermediálního fenotypu) u těchto nemocí. Moné efekty polymorfizmů v genu pro IL-18 u alergií nebyly dosud analyzovány, výzkum se doposud týkal především vztahu hladin IL-18 k jiným patologickým stavům. Pracoviště se v rámci nosného projektu již delší dobou zabývá problematikou genetiky atopických onemocnění a příspělo v této oblasti několika původními výsledky. Navrhovaný POST-DOC projekt vhodně rozšíří tu část nosného projektu, která se zabývá problematikou výše uvedených nemocí - jednak doplněním poznatků studiem dalšího kandidátního genu a zejména srovnáním těchto výsledků se situací u jednotlivých orgánových forem alergických onemocnění.

Rozbor problému
Atopická onemocnění typu astma bronchiale, alergické rýmy a atopické dermatitidy se řadí mezi tzv. civilizační choroby, na jejichž vzniku se podílí jak faktory genetické, tak i vlivy zevního prostředí. Podíl těchto dvou etiopatogenetických činitelů je u různých chorob různý. Podle epidemiologických studií výzkyt alergických nemocí neustále stoupá jak u dětí, tak u dospělých. Prevalance se geograficky i sociálně liší a zdá se, že ve vyspělých zemích je vyšší. Vysvětlení tohoto jevu je zatím nejasné.

Na rozdíl od monogenně dědičných nemocí jsou atopické choroby záležitostí interakce více genů a v nemalé míře se uplatňuje i vliv životního prostředí. Model polygenní dědičnosti prokázalo i mapování lidského genomu - na různých chromozomech byly nalezeny markery kandidátní geny pro atopii a některé genové varianty jsou s těmito chorobami již asociovány [1] . Naše pracoviště se již delší dobu zabývá problematikou genetiky atopických onemocnění a přispělo v této oblasti několika původními výsledky [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9] .

V kontextu dosavadních výsledků se jeví gen pro interleukin - 18 (IL-18) na chromozomu 11q jako další vhodný kandidát. IL-18, označovaný někdy též jako IGIF (IFN-?-inducing factor), je protein produkovaný především buňkami monocyto-makrofágové řady a dendritickými buňkami, ale schopnost jeho produkce byla prokázána i u mnoha dalších buněčných linií, jako jsou např. epitely dýchacích cest [10] . Uvolnění aktivní formy IL-18 je regulováno zevními stimuly, vedoucími zřejmě několika mechanismy (nejčastěji pomocí kaspázy - 1) aktivací biologicky inaktivního prekurzoru, skladovaného v buňkách i za normálních podmínek [11] . IL-18 je významný protizánělivý cytokin. Spolu s IL-12 aktivuje velké Th1 lymfocyty, indukuje produkci IFN-? a zvyšuje cytotoxicitu T-lymfotů a NK-buněk [12] . Podílí se tak na obraně proti infekci vyvolané zejména intracelulárními patogeny, zesiluje imunitní reakci na nádorové bujení a zřejmě hraje roli u některých autoimunních onemocnění.

Novější práce přisuzují IL-18 důležitou roli také v rozvoji atopických onemocnění. Účinky IL-18 totiž zřejmě závisejí na současném působení ostatních cytokinů [13] . Zatímco za přítomnosti IL-12 potencuje IL-18 tzv. Th1 imunitní odpověď, za spoluúčasti jiných cytokinů, jako např. IL-2 nebo IL-3, přispívá k aktivaci Th2 lymfocytů a vede k produkci IL-4 a IL-13 v bazovilech a žírných buňkách. [14] . Podle některých prací je IL-18 schopen zvyšovat hladinu sérových Ig-E protilátek in vivo [15] . Konečně některé práce prokázaly vyšší produkci IL-18, popř. jeho vyšší hladinu v krvi u pacientů s alergickou rýmou, bronchiálním astmatem a atopickým ekzémem oproti zdravým kontrolám [16, 17, 18] . Giedraitis et. al. [19] studoval 5' nepřepisovanou oblast genu pro IL-18 (lokus 11q22.2-q22.3) a popsal několik běžných polymorfizmů, experimentálně rovněž prokázal vliv některých jejich kombinací na expresi IL-18 [19] . Přestože některé ze zmíněných polymorfizmů byly studovány ve vztahu ke sclerosis multiplex [19] , diabetes mellitus [20] a enterocolitis necrotisans [21] , dosud nebyla publikována žádná studie zabývající se vztahem mezi genetickými variantami IL-18 a atopickým onemočněním.

Alergické nemoci jsou chronická zánětlivá onemocnění, často postihující několik orgánových systémů, které významně ovlivňují morbiditu a kvalitu života svých nositelů. Vzhledem k naznačeným souvislostem je možné předpokládat, že gen pro IL-18 by mohl být nadějným "kandidátním" genem pro výzkum genetické prodispozice k rozvoji alergického onemocnění, a asociační studie jednotlivých polymorfizmů nebo jejich kombinací by mohla vnést více světla do pochopení etiopatogeneze těchto chorob.

Cíle POST-DOC projektu
Cílem projektu je zhodnotit možný význam polymorfizmů v genu pro IL-18 v etiopatogeneze atopického astmatu, alergické rýmy a případně atopické dermatitidy a dále posoudit účast jednotlivých genových variant či jejich kombinací na vyjádření fenotypových markerů (intermediárního fenotypu) u těchto nemocí. Zamýšlíme studovat dva známé promotorové polymorfizmy ve vazebných místech pro transkripční faktory (-607C/A a -137G/C) a dále analyzovat genetický polymorgizmus v kódujících a regulačních oblastech genu pro IL-18 de novo. Ke studiu vztahu mezi genotypem (již popsaným či nově objeveným záměnami) a nemocí použijeme tzv. asociační přístup, a to jednak v modifikované podobě "kontroly-případy", a dále asociaci genetických parametrů s vybranými intermediárními znaky, což umožní posoudit i vztah genotypu k atopické predispozici a případně stupni bronchiální obstrukce. Možné efekty polymorfizmů v genu pro IL-18 u alergií nebyly dosud analyzovány, výzkum se doposud týkal především vztahu hladin IL-18 k různým patologickým stavům. Naším úmyslem je:

• analyzovat vybrané kódující a regulační oblasti genu pro IL-18
• porovnat genotypy v jednotlivých lokusech a jejich kombinacích mezi skupinou zdravých osob, pacientů s atopickým bronchiálním astmatem, alergickou rinitidou, atopickoudermatitidou či kombinací uvedených diagnóz, a to jak u dětských tak u dospělýchpacientů (modifikovaný přístup kontroly případy)
• v rámci naší české populace analyzovat asociace vybraných polymorfizmů v genu pro IL-18 s fenotypovými intermediárními znaky - se stupněm bronchiální obstrukce a atopickoupredispozici (s kožními "prick" testy na běžně užívané alergeny, s hladinami specifických IgE a příp. s hladinou celkového IgE v séru).

Návaznost na nosný projekt a údaje o nosném projektu
Nosný projekt Výzkumný záměr MŠMT CEZ J07/98: 141100002 Molekulární patofyziologie multigenních chorob řeší naše pracoviště od roku 1999. Hlavní pozornost je soustředěna na studium genetiky multifaktoriálních multigenních civilizačních onemocnění, zejména ischemické choroby srdeční, esenciální hypertenze, diabetu II. typu, atopických a onkologických onemocnění. Metodou studia jsou asociační studie vybraných a kandidátních genů (z hlediska jejich předpokládané účasti v patofyziologii daného onemocnění) s nozologickými jednotkami. Vzhledem k multigenní povaze dědičnosti těchto chorob je tento způsob nejpřínosnější. V poslední době se pracoviště věnuje i aktivnímu vyhledávání polymorfismů (SNP – single nucleotide polymorphism, délkových polymorfismů, repetic) a studiu interakcií jednotlivých SNP na úrovni komplexních alel u pacientů s danou chorobou. Tento postup například při studiu genetiky atopických onemocnění vedl k získání prioritních výsledků. Navrhovaný POST-DOC projekt vhodně rozšíří tu část nosného projektu, která se zabývá problematikou těchto nemocí – jednak doplněním poznatků studiem dalšího kandidátního genu a zejména srovnání těchto výsledků se situací u jednotlivých orgánových forem alergických onemocnění.

Navrhovaný postup řešení

1. První pokusný protokol
   V první fázi budou vyšetřeny stávající DNA vzorky pacientů dispenzarizovaných v několika laergologických ambulancí, a to především osoby s již diagnostikovanou a léčenou atopickou chorobou. Tyto představují skupinu nemocných, soubor je dále strukturován podle orgánového postižení. Kontrolní soubor je tvořen vzorky zdravých osob (věkově a zastoupením pohlaví odpovídají souboru pacientů).
   
   Anamnestická data od pacientů i kontrolních osob byla získána formou dotazníku, vzorek krve pro izolaci DNA byl odebrán v rámci kontrolních odběrů krve při návštěvě alergologické ambulance. Všechny osoby zařazené do studie, případně jejich zákonní zástupci, byli plně informováni o podstatě a důvodech studie, podepsali onformovaný souhlas a je garantována důvěrnost jejich osobních údajů. Studie je součástí širšího projektu Molekulární patofyziologie vybraných civilizačních, multigenně podmíněných chorob, který byl schválen Etickou komisí Lékařské fakulty Masarykovy univerzity. Z možností parametrů využívaných k diagnostice atopických chorob byly jako intermediární fenotyp vybrány následující parametry:
   1. kožní „prick“ testy s následujícími alergeny: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinum, běžné pyly trav, stromů a plevelů, alergeny srsti zvířat (kočka, pes), běžné plísně (Alternaria, Cladosporium, Aspergillus). Jako pozitivní kontrola byl použit histamin, jako negtativní kontrola fyziologický roztok
   2. vyšetření specifickýc IgE v séru
   3. vyšetření celkového IgE v séru
   
   Intermediární fenotyp bronchiálního astmatu posuzujeme následujícími parametry:
   1. bronchiální hyperreaktivita
   2. úprava dechových funkcí po podání ß-2 agonistů
   3. intraindividuální variabilita maximální expirační rychlosti (PEF) v čase
   4. spirometrické vyšetření (FEV1, FVC)
   
   Astma bronchiale bylo definováno dle kritérií Americké hrudní asociace (ATS, 1988). Diagnóza astmatu byla stanovena na základě přítomnosti jednoho nebo více astmatických symptomů (neproduktivní záchvatovitý kašel, pískoty, dušnost, reverzibilita obstrukce dýchacích cest a bronchiální hyperreaktivita). Atopická dermatitida byla definována na základě hlavních a vedlejších kritérií poprvé popsaných Hanifinem a Rajkou v roce 1980 (pro diagnózu je nutná přítomnost alespoň 3 hlavních a 3 vedlejších kritérií). Osoby s alergickou rinitidou (eventuálně rinokonjunktivitidou) mají známky atopie a symptomy buď sezónní (pylové) nebo celoroční potvrzené alergologem.



2. Genetická analýza
   Bude provedena genotypizace experimentálních subjektů na vybraných variabilních pozicích genu pro IL-18 (-607C/A a -137G/C). Současně budeme analyzovat genetický polymorfismus v kódujících a regulačních oblastech genu pro IL-18 de novo metodami heteroduplexní analýzy a SSCP (single strand conformation polymorphism) s následným sekvenováním heterozygotních vzorků. Obě zmíněné metody fungují na principu rozdílné migrace homo- a heterozygotních vzorků v polyakrylamidovém gelu. Odpovídajícími statistickými postupy shodnotíme eventuální asociaci polymorphismu v IL-18 se studovanými fenotypy. Pomocí multivariačních statistických metod budeme testovat závislost mezi klinicky manifestními projevy atopické predispozice (atopické astma, rýma, dermatitida nebo jejich kombinace), případně vybranými intermediárními fenotypy (hladinami celkového a spefického IgE v séru, kožní „prick“ testy, parametry bronchiální obstrukce), a odpovídajícími individuálními genotypy nebo jejich vzájemnými kombinacemi.

Očekávané výsledky a jejich prezentace
Projekt se řadí do proudu současného výzkumu, který se za pomoci nejnovějších molekulárně-biologických metod snaží porozumět genetickému podkladu komplexních multifaktoriálních nemocí. Tyto nemendelistické, běžné nemoci jsou hlavní přícinou morbidity a příp. mortality v průmyslově vyspělých zemích. Pochopení genetických příčin bronchiálního astmatu a dalších alergických nemocí by mohlo v konečném důsledku vést ke zlepšení preventivní strategie a diagnostických možností nepříjemných a někdy i život ohrožujících chorob. Znalosti genetické determinace náchylnosti k atopickým nemocem může mít přímí farmakogenetický efekt ve smyslu individuálně cílené terapie. Předpokládáme publikaci výsledků v „peer-review“ časopisech a aktivní účast na mezinárodních odborných konferencích zaměřených na alergologickou problematiku.