hlavička

MYKOTOXINY

verze (c) Jan Šimůnek

 

Analytika mykotoxinů


Ke stanovení mykotoxinů je možné využít jejich fyzikální, chemické a biologické vlastnosti. Metody stanovení se rozpadají na skupinu metod fyzikálně chemických a metod biologických. Existují i metody kombinované. Každá analytická metoda zahrnuje proces získání vzorku, jeho extrakci, čištění a detekci mykotoxinu. V některých případech však mohou být jednotlivé fáze sloučeny či silně redukovány.

 

Získání vzorku


Odběr vzorku představuje samostatnou kapitolu, přesahující rozsah a zaměření této publikace. Lékaři a zdravotničtí pracovníci obecně mívají tendenci tuto otázku podceňovat, protože se s ní při odběrech u pacientů prakticky nesetkáváme. Odběr a zpracování vzorků bývají pro některé potraviny a suroviny upraveny zvláštní normou a k dosažení reprodukovatelných výsledků je nutno předepsané postupy striktně dodržovat.

 

Extrakce


Extrakce má za účel převést co největší podíl testované látky ze vzorku do co nejmenšího objemu vhodného rozpouštědla z co nejmenším podílem rušících látek. Z tohoto důvody bývají často pro určité mykotoxiny v konkrétních substrátech předepsány směsi rozpustidel, které co nejlépe vyhovují uvedeným kritériím. Vedle klasické extrakce rozpustidly nebo směsmi rozpustidel nabývá na významu tzv. superkritická fluidní extrakce. Jejím principem je uvedení rozpustidla do superkritického stavu (překonání tzv. kritického bodu na diagramu teplota - tlak, za nímž již sebevětším tlakem není možno dosáhnout zkapalnění látky). Extrakce probíhá za teplot nejčastěji v rozmezí 25 - 200 oC a tlaku 7 - 60 MPa. (Je tedy použitelná jen pro látky, snášející uvedené podmínky.) Extrakčním činidlem jsou různé odolné plyny, metoda byla zavedena pro aflatoxiny s extrakcí CO2 s přídavkem dalších látek. Výhodou této extrakce je vysoká účinnost velmi malá spotřeba rozpouštědel. Nevýhodou je instrumentální náročnost.

 

Čištění extraktu


Čištěním zbavujeme primární extrakt dalších nežádoucích látek tak, aby bylo možné provést závěrečnou detekci. Rozeznáváme čištění ve fázích kapalina - kapalina, kapalina - pevná látka a čištění imunoafinní.
V případě čištění kapalina-kapalina převádíme testovanou látku z jednoho rozpustidla do druhého, popř. převádíme do jiného rozpustidla nežádoucí koextrahované látky. Výhodný je tento postup zejména u organických kyselin (z mykotoxinů například ochratoxin A nebo kyselina cyklopiazonová), které přecházejí z málo polárních rozpouštědel (dietyléter, chloroform) do alkalických vodných roztoků a po jejich okyselení zpět do méně polární fáze.
V případě čištění kapalina - pevná látka dochází k sorpci testované látky na povrchu vhodného sorbentu, vymytí nežádoucích zároveň adsorbovaných látek a následnému vymytí testované látky. Klasická sloupcová chromatografie postupuje tak, že sorbent je rozptýlen ve vhodné směsi rozpustidel a ponechán sedimentovat ve skleněné trubici. Poté skrze něj proléváme extrakt ze vzorku. Následuje prolévání vhodné soustavy rozpustidel, která vyplaví sledovanou látku ze sloupce. Nebo nejprve ze sloupce vyplavíme látky balastní a poté jinou soustavou vyplavíme analyzovanou látku. Ta je potom buď stanovována jinými postupy ve vytékající tekutině, nebo je přímo zachycována na výstupu (kapalinová chormatografie i vysokotlaká kapalinová chromatografie).
V současné době existují speciální kolonky, mnohdy připravené pro stanovení konkrétního mykotoxinu v určitém materiálu - skupině materiálů. Při jejich použití je nutno přesně dodržet návod výrobce. U barevných látek nebo látek detekovatelných UV zářením lze provést vyčištění rovněž na desce pro tenkovrstevnou chromatografii, skvrnu vyškrábat a testovanou látku ze sorbentu eluovat.
Imunoafinní kolonky představují prostupný gel v němž jsou ukotveny specifické protilátky proti mykotoxinu - skupině mykotoxinů. Extrakt je protlačen (nebo volně proteče) přes kolonku, nežádoucí látky jsou vymyty a poté je kolonka promyta rozpouštědlem, které ruší vazbu mykotoxin - protilátka. Výhodou jsou velmi malé objemy rozpouštědel a značná rychlost stanovení. Nevýhodou je vysoká cena kolonek, které jsou zpravidla výrobcem určeny k jednomu použití.

 

Detekce


Rozlišujeme detekci kvalitativní (látka je-není přítomna), semikvantitativní a kvantitativní (stanovujeme též množství). Použité metody lze rozdělit na fyzikálně-chemické a biologické.

 

Přehled konkrétních metod

 

Návrat na úvodní stranu