hlavička

MYKOTOXINY

verze (c) Jan Šimůnek

 

Biologické metody


Z biologických metod se nejčastěji používají imunologické metody RIA a ELISA. Jsou založeny na imunitní reakci sledované látky s protilátkami. Mykotoxiny zpravidla nevyvolávají imunitní odezvu s tvorbou protilátek, ale působí jako hapteny. To znamená, že po navázání na vhodný nosič (např. bílkovinu) vyvolají tvorbu specifických protilátek.
Ty se buď získávají ze séra imunizovaného zvířete, nebo jde o tzv. monoklonální protilátky. Pro jejich výrobu se užívá lymfocytů B z imunizovaného zvířete, které fúzují s vhodnou nádorovou či leukemickou buňkou. Jejich splynutím vzniká "nesmrtelná" buňka, která se v zásadě neomezeně dělí a produkuje specifické protilátky. Monoklonální se tyto protilátky nazývají z toho důvodu, že produkující buňky jsou všechny potomky jediné buňky. Proto produkují též zcela shodnou protilátku. V případě séra z imunizovaného zvířete jde o směs sice podobných ale v detailech odlišných protilátek, jejíž reakce jsou méně jednoznačné a jejíž vlastnosti mohou šarži od šarže mírně kolísat. Monoklonální protilátky zajišťují vyšší úroveň standardizace metody. Lze očekávat, že časem budou klasickým protilátkám konkurovat i cenově.
Metoda existuje v četných úpravách.
Např. je možno do vzorku přidat standardní množství značeného mykotoxinu a oba nechat vyvazovat na protilátky, fixované na stěně zkumavky. Při vazbě dochází ke kompetici mezi značeným a neznačeným mykotoxinem. Radioaktivita či enzymatická aktivita zkumavky po šetrném odstranění nevyvázaného značeného mykotoxinu je nepřímo úměrná množství mykotoxinu ve vzorku. Existují i postupy, při nichž probíhá imunologická reakce v prostředí gelu, nikoli na stěně zkumavky. U řady látek (nejen mykotoxinů) je možno detekovat až pikogramové koncentrace, což odpovídá desítkám molekul v mililitru testovaného roztoku.
ELISA má proti RIA výhodu jednoduššího odečítání výsledku (zpravidla v závěru stačí změření intenzity zabarvení roztoku jednoduchým fotometrem), zavádí však do reakce další citlivou bílkovinnou molekulu (enzym), jejíž vlastnosti mohou být pozměněny balastními látkami ze vzorku a podílejí se na stárnutí analytického kitu (sady).
Obě metody, RIA i ELISA, bývají zpravidla vypracovávány pro konkrétní přesně definované látky. Např. stačí již přechod z mléka kravského na mléko mateřské aby metoda přestala dávat uspokojivé výsledky a bylo nutno ji přepracovat. Jsou popsány také četné falešně pozitivní výsledky (např. aflatoxin B1 má zkříženou reakci s vanilinem). Velmi nepřehledné jsou zkřížené reakce mezi mykotoxiny vzájemně genericky odvozenými (skupina aflatoxinů, zearalenon a příbuzné, trichotheceny apod.). Rovněž je zdrojem laboratorních chyb i fakt, že mnohé mykotoxiny jsou v biologickém materiálu konjugovány s glukuronidy, přičemž o reakci výsledných komplexů s protilátkami proti mykotoxinu se vesměs málo ví. Zpravidla existuje více možností vazby mykotoxinu s kyselinou glukuronovou a výsledné látky mohou mít afinitu k protilátkám proti mykotoxinu výrazně odlišnou. Z tohoto důvodu se používá imunologických metod především v rámci výzkumu, popř. vnitropodnikového sledování, kde vynikne jejich vysoká citlivost (alespoň v případě aflatoxinů, ochratoxinu, zearalenonu apod.) a možnost automatizace celého postupu. V případě právně závazného porovnání s normou jsou naměřené hodnoty kontrolovány fyzikálně chemickými metodami.
Rozvoj výroby protilátek proti mykotoxinům umožnil jejich vyzkoušení v terapii mykotoxikóz. Klinická odezva byla pozitivní (u prasete), jejich nasazení v případě např. laboratorní nehody je záležitostí ceny a rychlé dostupnosti.

 

Toxikologické metody


Toxikologické metody se v současné době používají minimálně. V souvislosti s akcemi tzv. "ochránců zvířat" poklesla dostupnost a zvýšily se náklady. Velmi účinné byly testy, detekující estrogenní látky (mykotoxin zearalenon) na základě zvětšení dělohy u nedospělých samiček potkanů a myší. Výhodou těchto testů je detekce všech látek s daným biologickým účinkem, tedy i metabolitů obtížně stanovitelných klasickými chemickými metodami (nejsou k dispozici standardy toxinů).
Určitý význam zůstává u testů na kuřecím embryu (příslušná legislativa se vztahuje až na vylíhnutá kuřata).
Orientační hodnotu mají testy na bezobratlých. V případě mykotoxinů je užívána zejména žábronožka (Artemia salina, popř. A. minima). Podobně lze užít i prvoky - Paramecium caudatum aj. Takovéto testy byly např. užity při detekci satratoxinů a dalších makrocyklických trichothecenů maďarskými autory. Velmi výhodná je úprava s použitím mikrotitračních destiček. Materiál s mykotoxinem je nejlépe aplikovat tak, že do jamky s detekčními organismy ve vhodném médiu ponoříme disky z filtračního papíru, nasáknuté studovaným extraktem a dobře usušené. Při použití skleněných destiček je možno aplikovat roztoky na dno jamek a po usušení přidat médium s organismy; použitá rozpustidla zpravidla rozpouštějí hmotu mikrotitračních destiček, takže s nimi je tento klasický postup nepoužitelný.
Různí autoři studovali vliv některých mykotoxinů na tkáňové kultury, ale spíše v rámci výzkumu jejich účinků než jako detekční systém.
V některých případech jsou popsány účinky dosti specifické, např. vymizení chloroplastů u rostlinných buněk vyvolané aflatoxiny.
Lze detekovat i vznik mutagenních metabolitů v exponovaných organismech či samotnou mutagenní aktivitu některých mykotoxinů (Amesův test, SOS - chromotest). Tyto testy jsou však velice drahé, náročné na přesnost postupu a použité chemikálie a nejsou specifické. Pokud je potřebujeme provést u malého množství vzorků, je vhodné zadat tuto práci specializované laboratoři.

 

Mikrobiologické metody


Relativně nenáročné, zejména z hlediska materiálního vybavení, jsou testy mikrobiologické. Lze detekovat blokádu růstu testovacího kmene kolem disků s obsahem mykotoxinu. Podezření na konkrétní mykotoxin je dáno jednak postupem přípravy vzorku (který vyloučí přítomnost některých mykotoxinů na disku) jednak použitím kmene se selektivně vysokou citlivostí k určitému mykotoxinu - skupině mykotoxinů.
V některých případech lze použít selektivní blokádu účinku mykotoxinů některými látkami. V literatuře je popsána blokáda účinku aflatoxinů kumarinovými preparáty a blokáda patulinu a kyseliny penicillové látkami s -SH skupinami. Ve druhém případě se podařilo na LF MU vyvinout metodu stanovení patulinu, spočívající v aplikaci dvou disků s hrubým etylacetátovým extraktem vzorku na půdu s citlivým mikrobem, přičemž na jednom je vedle vzorku přidáno i standardní množství thioglykolátu sodného. Pro přítomnost patulinu je charakteristický výrazný rozdíl velikostí zón inhibice růstu použitého mikroba kolem disků.
Rozhodujícím momentem všech uvedených metod je konstantní tloušťka a rovnoběžnost vrstvy vylité půdy, což je technicky dosti náročné. Zdrojem chyb mohou být antibioticky působící látky, proto je použití metod omezeno především na substráty, kde není výskyt podobných látek obvyklý.
Je možná úprava mikrobiologické metody k odečítání chromatogramů. Je nutno zajistit planparalelnost vrstvy živné půdy (nejčastěji s inkorporovaným mikrobem).
Baktericidní substance se na půdě projeví ploškou s inhibovaným růstem. Vedle citlivosti použitého mikroba je zde důležitým ukazatelem i Rf skvrny, které lze porovnávat s Rf standardu (v takovém případě aplikace mikroba pouze nahrazuje postřik chromatogramu detekčním činidlem).
Uvedené metody mají svůj význam hlavně pro mikrobiologické laboratoře, nevybavené k použití složitějších chemických metod. Mohou mít svůj význam u těch toxinů, kde jsou nedostupné specifické chemické reakce, proveditelné přímo na chromatogramu, a látky je příliš málo pro její bližší určení fyzikálně chemickými metodami.

 

Jednotlivé biologické metody, vyvinuté nebo upravené na našem pracovišti

Stanovení toxicity pomocí larev Artemia salina

Stanovení toxicity pomocí buněk Paramecium caudatum a Euglena gracilis

Odečtení chromatografie pomocí mikroorganismů

Stanovení zearalenonu toxikologicky

 

Návrat na úvodní stranu