hlavička

MYKOTOXINY

verze (c) Jan Šimůnek

 

Fyzikálně chemické metody


Z fyzikálně chemických metod je nejčastější chromatografie. Využívá různé rychlosti prostupu jednotlivých látek unášených směsí rozpouštědel skrze vrstvu vhodného sorbentu. Nejznámější a nejčastěji používané úpravy chromatografie jsou:

 

a- sloupcová chromatografie , kdy sorbent je v kompaktním sloupci, obklopeném trubicí ze vhodného materiálu. Od této metody, v nynější době spíše zastaralé, jsou genericky odvozeny další, vysoce moderní metody kapalinové chromatografie, vysokotlaké kapalinové chromatografie (a provedením blízká je i chromatografie plynová).
V některých případech je možné vyčištěné látky na sloupci pozorovat ve viditelném nebo UV světle, popř. i stanovit jejich množství. V současné době jsou však tyto metody zastaralé.
Sloupcová chromatografie je v současné době používána k předčišťování vzorků, které jsou poté analyzovány jinou metodou, citlivou na přítomnost balastních látek (viz výše).
Jinou doménou použití sloupcové chromatografie je preparace většího množství látek za účelem jejich přípravy.

b- Tenkovrstevná chromatografie (TLC) je založena na vzlínání směsi rozpustidel v tenké vrstvě sorbentu na povrchu vhodného nosiče. Vzorek se zpravidla na vrstvu nanese předem. Po přechodu rozpustidla přes nanesený vzorek jsou jednotlivé jeho složky unášeny různou rychlostí po vrstvě sorbentu. Jakmile dojde čelo rozpustidla na konec desky, jeho pohyb se zastaví. Analyzovanou látku pak sledujeme buď přímo (barevné) nebo pod ultrafialovým světlem (ty, které světélkují pod UV světlem dostupných vlnových délek) nebo ji vizualizujeme postřikem vhodným chemickým činidlem.
Hodnota Rf udává, jak daleko zaostává skvrna sledované látky proti čelu rozpustidla na desce. Rf 1,0 mají látky jdoucí s čelem soustavy, Rf 0 mají látky, zůstávající na startu.
Tenké vrstvy jsou v současné době používány prakticky jen kupované od různých výrobců. U nás je to nejčastěji Silufol od výrobce Chevalier. Při použití vrstvy musíme znát její vlastnosti, z níž plynou některá omezení. Například Silufol je na aluminiové fólii a silikagel ve vrstvě je spojen škrobem. Nelze proto používat jako unášecí soustavy či detekční činidla silné kyseliny a zásady, které by destruovaly hliníkovou vrstvu. Je problémem použití detekčních činidel s obsahem jódu, který ve větším množství zabarvuje desku intenzívně modře (reakce se škrobem). Je nepoužitelná i všeobecná detekce postřikem koncentrované kyseliny sírové a zahřátím (kdy detekujeme většinu organických látek na základě zčernání - vyredukování uhlíku). Zato je však deska daleko pružnější než desky skleněné, levnější než teflonové (např. od fy. Kodak).
Při tenkovrstevné chromatografii mykotoxinů se osvědčuje nanášet na desku vždy vzorek, standard mykotoxinu a vzorek s přidaným standardem. Za těchto podmínek velice snadno odhadneme ovlivnění Rf mykotoxinu balastními látkami ve vzorku. Zjistíme i případy, kdy balastní látky různými mechanismy blokují detekci mykotoxinu nebo jeho oddělení od balastu. Rovněž takto snadněji objevíme látky, které se sledovanému mykotoxinu velmi podobají (barva, fluorescence, barevná reakce) a mají velmi podobné Rf (skvrna ve vzorku se standardem je jakoby rozštěpená).
Výhodou tenkovrstevné chromatografie je relativní odolnost vůči příměsem balastních látek. Vzorek zpravidla není nutno tak důkladně čistit, což vedle úspory práce, času a materiálních nákladů znamená i menší riziko ztrát při čištění. Druhou výhodou je získání celkového přehledu o vzorku (jsme schopni např. zaznamenat výskyt látek, dávajících podobné nebo identické chemické reakce) a možnost důkladnějšího studia chemických a fyzikálních vlastností podezřelé látky. Nevýhodou je obtížnější a méně přesná kvantifikace.
Kvantifikace výsledku se provádí přístroji, měřícími odražené světlo popř. fluorescenci chromatografické desky. Přístrojů k tomuto stanovení existuje celá řada, modernějšími lze odečíst i excitační a emisní maxima fluoreskujících skvrn (tj. jaká vlnová délka UV záření vyvolá nejvyšší fluorescenci a jaká vlnová délka je emitována - popř. jaká jsou maxima emise). Excitační a emisní maxima jsou pro soustavu látka - sorbent značně specifická a porovnání se standardem toxinu na téže desce snižuje možnost falešně pozitivních výsledků na minimum.
Existuje rovněž vysokoúčinná tenkovrstevná chromatografie (HPTLC), která pracuje se speciálními deskami, jejichž sorbent je velmi jemný a zejména je zajištěna vysoká stejnorodost jeho zrn z hlediska velikosti a tvaru. Pracuje se s malými deskami a množství nanášeného vzorku je velmi malé.
Zastaralá je kdysi rozšířená papírová chromatografie - mimo speciální případy nebo výuku.

c- vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) používá drobné kolonky, skrze něž je unášecí soustava protlačována pumpou. Modernější přístroje umožňují také např. kontinuálně měnit složení unášecí soustavy. Průchod sledovaných látek skrze kolonu je detekován na výstupu zpravidla na základě fyzikálních vlastností roztoku. Nejčastěji jde o absorpci viditelného, infračerveného nebo ultrafialového světla. Existují i detektory fluorescence, vyvolané ultrafialovým světlem. V případě analýzy aflatoxinů se používá tzv. packed flow cell, což je kyveta z křemenného skla naplněná silikagelem. Ten totiž značně zesiluje fluorescenci aflatoxinů a tím vzrůstá až o řád citlivost detekce.
Při praktickém provádění analytiky pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie je nutno se velice striktně držet již vypracovaných metod včetně takových detailů, jako je použití chemikálií a kolonek od konkrétního výrobce. Metody bývají také zpravidla vypracovány pro určitý okruh materiálů a u jiných je nutno změnit alespoň úvodní čištění vzorků. Nevýhodou je také značná materiálová náročnost plynoucí z nákladů na pořízení a provoz přístroje.
Hlavním problémem vysokotlaké kapalinové chromatografie jsou ztráty při čištění. Mohou se měnit podle použité metody i analyzovaného materiálu.
Kapalinová chromatografie pracuje na stejném principu, ale vzorek a soustava protékají kolonkou samospádem nebo mírným přetlakem. Proto musí být sorbent v kolonce hrubozrnnější a kolonka celkově větší. Je méně používána než vysokotlaká chromatografie, ale v některých případech dosahuje plně postačujících výsledků.
Porovnáme-li kvantifikaci mykotoxinů tenkovrstevnou a vysokotlakou kapalinovou chromatografií, pak obě metody mají výhody a nevýhody. Kvantifikace TLC je zpravidla méně přesná (chyba 5 - 10%, podle použitého přístroje), ale čištění vzorku může být méně náročné. HPLC kvantifikuje s vysokou přesností, ale je nutno použít velmi účinné čistící postupy, při nichž dochází ke značným ztrátám. V závislosti na složení substrátu procento ztrát při čištění kolísá. Při testování velkého množství různorodých materiálů, pro něž ztráty nejsou přesně známy, můžeme v praxi dosáhnout méně přesných výsledků než při TLC.

 

Jednotlivé fyzikálně-chemické metody, užívané na našem pracovišti

Stanovení aflatoxinu modifikovaně podle Velasca

Konfirmační test na aflatoxiny

Stanovení ochratoxinu A v běžných potravinách

Stanovení patulinu v jablečné dřeni, jablečném džusu, jablečné dětské výživě

Stanovení T-2 toxinu podle Eppleye

 

Jednotlivé fyzikálně-chemické metody, vyvinuté nebo upravené na našem pracovišti

Stanovení toxinogenity

Stanovení kyseliny cyklopiazonové v sýrech s bílou plísní na povrchu

Stanovení většího počtu mykotoxinů současně ve vzorcích silně znečištěného materiálu

 

Návrat na úvodní stranu