hlavička

MYKOTOXINY

verze (c) Jan Šimůnek

 

Toxinogenita

Toxinogenitou se nazývá schopnost organismů tvořit toxiny. Aplikováno na mikroskopické houby - jde o schopnost tvorby mykotoxinů.
Všechny kmeny druhů mikroskopických hub, u nichž byla zjištěna produkce určitého mykotoxinu, považujeme za potenciálně toxinogenní pro daný mykotoxin. Pokud u konkrétních kmenů stanovíme toxinogenitu, hovoříme potom o toxinogenitě (pozitivní) nebo netoxinogenitě (negativní). Pozitivní toxinogenita pak znamená, že daný kmen je za určitých podmínek schopen produkovat daný mykotoxin. Vyšetření konkrétního kmene má tedy vždy vyšší výpovědní hodnotu než pouhé konstatování jeho příslušnosti ke druhu, který je schopen v některých případech produkovat mykotoxiny.
Tvorba mykotoxinů je závislá vedle druhu mikroskopické houby na chemických, fyzikálních a biologických podmínkách růstu.
Mykotoxiny nejsou přímo genové produkty. Jsou to sekundární metabolity, jejichž tvorba závisí na souhře enzymatických aktivit v buňce. Na druhé straně ovšem neexistence genů pro klíčové enzymy této tvorby je spojena s naprostou neschopností kultury tvořit daný mykotoxin (skupinu mykotoxinů).
Z hlediska druhových či genetických podmínek toxinogenity jde o schopnost houby produkovat ty enzymy, které se podílejí na přeměně prekursoru, zpravidla přes meziprodukty, na mykotoxin. Některé prekursory mohou být samy o sobě rovněž mykotoxiny. Nalézáme je u některých druhů, neschopných jejich další přeměny. U druhů, kde biochemická přeměna pokračuje k dalším látkám, je nacházíme často pouze ve stopových koncentracích. Např. versicoloriny jsou poměrně častým toxickým metabolitem některých druhů rodů Aspergillus a Penicillium. V některých kmenech A. flavus nebo A. parasiticus hází k jejich další přeměně, jejímž výsledkem jsou mj. aflatoxiny. V některých případech je popsána schopnost produkovat více konečných sloučenin v závislosti na tom, jaké enzymy jsou v kultuře aktivní. Převahy určité konkrétní sloučeniny v kultuře lze potom dosáhnout např. změnou teploty nebo specifickými inhibitory některých enzymů.
Mezi nejdůležitější fyzikální vlastnosti ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří teplota. Zpravidla existuje určité teplotní rozmezí, uvnitř kterého mohou být mykotoxiny vytvářeny, přičemž od optima směrem k limitům klesá jednak množství produkovaného toxinu, jednak často i procento kmenů, schopných produkovat detekovatelné množství mykotoxinu. Polster (74) opakovaně konstatoval. že nenalezl u kmenů Aspergillus flavus produkci aflatoxinů při teplotě nižší než 16 oC. Podobně je tomu i s dalšími toxinogenními plísněmi. U kmenů některých druhů rodu Fusarium je nutno provádět kultivaci při nižších teplotách než je laboratorní. Provádí se to ve speciálně upravených chladničkách, zapojený jako termostat.
Důležité jsou osmotické vlastnosti substrátu, charakterizované nejlépe tzv. vodní aktivitou (aw). I zde existuje zpravidla rozmezí hodnot, uvnitř kterého lze zaznamenat produkci mykotoxinů. Je nutno zdůraznit, že posun aw mimo optimální hodnoty neznamená usmrcení kultury. Dochází k přežívání spor a za určitých okolností i myceliálních buněk. Po návratu vodní aktivity do rozmezí slučitelného s dalším růstem plísně dojde k jejímu dalšímu nárůstu.
Posun teploty a vodní aktivity mimo optimální či růstové rozmezí kultury nemusí vždy omezit enzymatickou aktivitu kultury a zejména aktivitu těch enzymů, které se uvolnily do substrátu. Některé nežádoucí změny substrátu (potraviny, krmiva, suroviny) mohou tedy probíhat i za podmínek neslučitelných s vitální aktivitou celého plísňového organizmu.
Struktura substrátu, popř. skupenství, může výrazně ovlivňovat jak dostupnost chemických látek ze substrátu, tak i přístup vzduchu k myceliu. Je rozhodující i pro to, zda mycelium bude vytvářet pouze povrchovou vrstvu, nebo zda výrazněji proroste do hloubi substrátu. Z tohoto důvodu bývá větší výnos mykotoxinů na granulovaném substrátu, který plíseň prorůstá v celém objemu. Naopak u kultivace v tekutých půdách bývá při zachování stejné plochy hladiny přidávání dalšího objemu půdy z hlediska produkce mykotoxinů neefektivní (výhodnější je rozdělit půdu do více nádob, aby její vrstva nepřevyšovala cca 2 cm). Lepší laboratorní vybavení umožňuje poržávat třepačkové kultury,, které autu nevýhodu zčásti odstraňují stálým pohybem kultivačního média.
Čas musíme chápat jako rovněž fyzikální veličinu. I na něm závisí obsah mykotoxinů v substrátu, protože mycelium začne produkovat měřitelná množství mykotoxinů až po určité době (Aspergillus flavus dle našich zkušeností od období, kdy začne sporulovat) a po vyčerpání zdrojů v substrátu se produkce zastaví. Obsah mykotoxinů poté klesá přirozeným rozkladem, v některých případech i enzymatickou dekompozicí. Polster (75) uvádí rychlejší úbytek aflatoxinů v nedostatečně vyčištěných standardních roztocích.
Z chemických faktorů je důležitý přísun energie a nezbytných chemických látek, které buňky mikroskopických hub potřebují jako vstup do svého metabolismu. V některých případech je ovšem množství živin na škodu produkce mykotoxinu, protože kultura není nucena aktivovat některé enzymatické systémy a jejich nízká aktivita v kultuře vede i k nízké až nedetekovatelné produkci sekundárních metabolitů. Setkali jsme se se snížením až zástavou produkce kyseliny cyklopiazonové na půdách s obsahem peptonu.
Důležitý je přísun kyslíku. Při jeho nedostatku dochází k poklesu produkce mykotoxinů a posléze k zástavě růstu kultury (54, 134).
Naopak je znám vliv látek aktivujících enzymatické systémy, jako jsou např. barbituráty, PCB, některá rozpouštědla a pod., které mohou produkci mykotoxinů až zmnohonásobit. Zvýšení produkce mykotoxinů bylo popsáno rovněž při fortifikaci média některými mikroelementy nebo jejich směsí (22, 23, 24, 62).
Významné jsou i faktory biologické. Je popsán prudký pokles produkce mykotoxinů ve směsných kulturách (111). Setkali jsme se s prudkým poklesem produkce aflatoxinu B1 kulturou Aspergillus parasiticus NRRL 2999 po několika přeočkováních. Byla zachovány předchozí pasáže i původní kultura, na nichž bylo možno pozorovat, jak produkce aflatoxinu pasáž po pasáži klesá. Při velmi řídkém výsevu a izolaci subkultur z jednotlivých kolonií jsme pozorovali značné rozdíly v produkci mykotoxinů mezi nimi. Podobné pozorování je známo i z literatury (82) u produkce ochratoxinu A.
Silný pokles produkce mykotoxinů lze vysvětlit tím, že při pasážování kultury vznikají netoxinoxenní mutanty. Jejich přibývání ve směsné kultuře poté vede k rychlé ztrátě produkce mykotoxinů. Japonští autoři (111) pozorovali snížení až ztrátu produkce aflatoxinů kulturou Aspergillus flavus pokud byla ve sporách produkčního kmene příměs spor netoxinogenního kmene, popř. jiného druhu (Aspergillus niger).
Vyčištěním kultury, popř. zajištěním jednotné linie opakovanou monosporickou kultivací lze produkci mykotoxinu kulturou alespoň v některých případech buď zvýšit nebo obnovit. K poklesu produkce často dochází u déle uchovávaných kmenů během pasážování, někdy skokem někdy postupně, a to i při dodržení správných zásad manipulace s kulturou. S tímto nežádoucím jevem se setkali pracovníci Alma-Atského Institutu pitanija. V době mé stáže na uvedeném pracovišti byly sledovány starší a novější subkultury kmene Aspergillus parasiticus NRRL 2999. U starších kultur byla produkce aflatoxinů výrazně silnější než u přeočkovaných. Při řídkém roztěru spor a izolaci jednotlivých subkultur byly zjištěny rozdíly v produkci aflatoxinů (8). V souladu s výsledky japonských autorů (111) se lze domnívat, že výskyt neaflatoxinogenních mutant v potomstvu kultury vede k inhibici produkce aflatoxinů ve směsné kultuře s těmi, které si schopnost produkce aflatoxinů dosud zachovaly. Podobný jev je znám i u producentů ochratoxinu A (48). Na našem pracovišti jsme podobně sledovali produkci kyseliny cyklopiazonové kmeny Aspergillus flavus při opakovaném pasážování na různých substrátech. Pozorovali jsme značné rozdíly v produkci mykotoxinu jednotlivými subkulturami, ale nenalezli jsme jednoznačné vztahy k substrátům, na nichž byly subkultury pasážovány (40). Tato práce (40), bohužel, probíhala v době, kdy jsme ještě neměli k dispozici kvantitativní kolorimetrickou metodu stanovení tohoto mykotoxinu. Semikvantitativní porovnání produkce kyseliny cyklopiazonové subkulturami, pasážovanými na různých typech půd a porozených substrátů, vyznělo nepřesvědčivě.
Podobně se při opakovaném pasážování mění morfologické (především makromorfologické) znaky plísňových kultur. Tento nepříjemný jev mj. zabraňuje využití standardních kultur jako porovnávacího materiálu pro výuku začátečníků či laboratorní praxi obecně. Z tohoto důvodu je třeba pracovat především s čerstvě zachycenými či jen krátce pasážovanými kmeny a mít na pracovišti zaškoleného zaměstnance, který je dovede určit (25). Změnu v této situaci snad přinesou až lyofylizáty, které by měly uchovat původní vlastnosti kmene po velmi dlouhou dobu.
V případě mykotoxinů užívaných jako průnikový faktor (např. xanthomegnin a příbuzné látky u některých dermatofyt) lze předpokládat i ovlivnění interakcí parazit - hostitel (112).
V praxi je nejvíce známo o produkci aflatoxinů a trichothecenových mykotoxinů.
U producentů aflatoxinů je znám komplex fyzikálních podmínek umožňujících produkci toxinů. Jsou propracovány vlivy řady chemických látek s inhibičním či naopak stimulujícím účinkem na produkci aflatoxinů. Velmi silně zvyšující účinek mají látky, ovlivňující aktivitu enzymatického komplexu cytochromu P-450 (24).
Jsou rovněž známy kmeny, produkující atypické deriváty aflatoxinů. Například aflatoxiny řady M byly původně popsány jako do mléka přecházející metabolity aflatoxinů řady B (11). Nyní jsou známy i kmeny Aspergillus flavus či A. parasiticus, produkující tyto metabolity. Jsou využívány ke komerční produkci těchto aflatoxinových derivátů (26, 85).
U hub z rodu Fusarium, produkujících trichotheceny, je zase popsána závislost konkrétního konečného produktu na teplotě. U některých kmenů lze pouhou změnou teploty dosáhnout toho, že je produkován jiný mykotoxin trichothecenové řady (112). (Obvyklá je masivní produkce jednoho trichothecenu s tím, že při dostatečném množství kultury a dostatečné citlivosti metody lze nalézt ještě několik dalších příbuzných látek, vyskytujících se ve výrazně menším množství.)
Jsou známy i případy, kdy výskyt toxinogenních kmenů je ovlivněn patrně komplexem faktorů. Například je výrazný rozdíl v procentuálním zastoupení toxinogenních kmenů Aspergillus flavus (tvorba aflatoxinů a kyseliny cyklopiazonové) v záchytech z různých potravinářských komodit, popř. v rámci téže komodity z různých míst původu. Výskyt producentů aflatoxinů je zpravidla mnohem vyšší mezi kmeny z arašídů než mezi kmeny ze sušeného mléka. U kmenů z arašídů jsou výrazné rozdíly podle produkujícího státu, resp. regionu (5, 78).
U fusarií je známa v Eurasii produkce T-2 toxinu a příbuzných mykotoxinů. V severoamerické obilnici (jih Kanady a sever USA) převažují kmeny produkující deoxynivalenol, 15-acetyl-deoxynivalenol, zearalenon aj. V Austrálii, Japonsku a Itálii byla místo 15-acetyl-deoxynivalenonu pozorována produkce 3-acetyl-deoxynivalenolu.
Toxinogenita je stanovována zpravidla kultivací izolovaného kmene za standardních podmínek, které se podle autora metody blíží optimálním podmínkám produkce mykotoxinu. V některých případech je možné volit takové složení substrátu, které umožňuje zjednodušený postup při jeho analýze. Toto si můžeme demonstrovat na následujícím příkladě:
Pro aflatoxiny byla vypracována metoda stanovení jejich produkce kmeny Aspergillus flavus a A. parasiticus na karlovarských sucharech. Na uvedeném substrátu dochází poměrně rychle k silné produkci aflatoxinů, dané patrně kombinovaným vlivem struktury, obsahu živin a obsahu mikroelementů v tomto materiálu. Suchary rovněž prakticky neobsahují látky rušící při tenkovrstevné chromatografii, takže lze analyzovat již hrubý acetonový nebo chloroformový extrakt z kultury bez jakékoli další úpravy kromě zahuštění (94).
Uvedená metoda v případě plísně Aspergillus flavus nezachytí tvorbu jiného mykotoxinu, kyseliny cyklopiazonové. Její produkci je nutno stanovovat na kapalné půdě se sacharózou a kvasničným autolysátem (popř. yeast extract). Liší se rovněž délka kultivace a teplota. Za těchto podmínek silně aflatoxinogenní kmeny A. flavus produkují i aflatoxiny, avšak ve výrazně nižší koncentraci .
Produkci dalších mykotoxinů Aspergillus flavus, např. aflatremu, bude nutno stanovovat dalšími postupy.
Správně stanovená toxinogenita by v případě negativního výsledku měla zaručit vysokou pravděpodobnost toho, že testovaný kmen nebude produkovat daný mykotoxin. Pozitivní výsledek znamená pouze to, že zachycený kmen je schopen za jistých okolností stanovovaný mykotoxin produkovat. Určitou orientací může být kvantita a kvalita zaplísnění substrátu. Byl-li nárůst plísně malý a šlo především o vegetativní mycelium, lze očekávat i malý resp. žádný nález mykotoxinu v něm. Pokud byl nárůst masivní a došlo až ke sporulaci kultury, lze očekávat výskyt mykotoxinu (jeho produkce však bude i za těchto okolností ve většině případů nižší, než v modelovém pokusu). V některých případech se mohou v přirozeném substrátu vyskytovat i látky, které v praxi i v experimentu inhibují tvorbu mykotoxinu. V substrátu může být přítomna i mikroflóra, ovlivňující produkci mykotoxinů (75, 98, 111, 120).
Ideální by bylo stanovit produkci mykotoxinů přímo na substrátu, z něhož byly kmeny izolovány. To však často naráží na nepřekonatelné obtíže při zajištění jeho sterility aniž by došlo k jeho výrazným fyzikálním či chemickým změnám. U choulostivých substrátů s nízkým výskytem mikrobiální flóry je metodou volby masivní kontaminace testovaným kmenem.
Přítomnost spor toxinogenního kmene neznamená zdaleka ještě výskyt mykotoxinů. V naprosté většině případů jsou samy o sobě prosty mykotoxinů, jen několik málo druhů plísní obsahuje významné množství svých mykotoxinů ve sporách (Stachybotrys atra, Pithomyces chartarum) (138, 140). Znamená však, že jakmile nastanou vhodné podmínky pro růst mycelia a produkci mykotoxinů, pak k této produkci s vysokou mírou pravděpodobnosti také dojde. Uvedené testy proto chápeme jako pomoc při vytváření postupu, jak bude s testovaným materiálem dále nakládáno, jaký typ dopravy a uskladnění snese atd.

 

Návrat na úvodní stranu