Použité tkáňové kultury

V laboratoři genové exprese se pracuje s primokulturami lidské endoteliální tkáně a se stabilizovanými buněčnými liniemi lidského (linie HeLa, MCF7, HepG2, H1299) a živočišného (BAEC 2.2 U7, BAEC 3.1 c1XX) původu, přičemž většina těchto linií je nádorově transformovaná. Stabilizované linie savčího původu jsou obvykle zařazovány do nejnižší kategorie rizika (biosafety level BSL-1), neboť u zdravých dospělých lidí nezpůsobují onemocnění. Linie lidského původu (nádorově transformované i nenádorové) jsou pak řazeny do první (BSL-1) nebo druhé (BSL-2) kategorie rizika, neboť některé jejich vlastnosti (obvykle přítomnost částí virového genomu) pro člověka mohou představovat určité zvýšené riziko.

Tkáňové kultury použité pro konkrétní účely:

Linie N3PGL3B-H1299	příjemce
	linie H1299 (stabilizovaná linie lidského plicního karcinomu)
	vložený dědičný materiál (pocházející z dárcovského organismu)
	gen pro NOS 3 (Endoteliální syntáza NO) s genem pro hmyzí luciferázu)
	vektor
	PGL3-Basic (Promega, USA)
	dárcovský organismus
	Homo sapiens (gen pro NOS3), Photinus pyralis (gen luc+)
	vložení konstruktu
	nukleofekce do savčích buněk
	signální a selekční marker
	jako signální marker se používá přímo gen luc+ kódující enzym luciferázu
	inzert
	alelická varianta genu NOS3
	vynětí části dědičného materiálu
	ne
	výsledný geneticky modifikovaný organismus
	linie N3PB-H1299, krátkodobě (24 hodin) exprimující signální gen

Linie RAGEPGL3B-ENDO742	příjemce
	linie ENDO 742 (znesmrtelněná linie lidských endoteliálních buněk z lidské prsní žlázy)
	vložený dědičný materiál (pocházející z dárcovského organismu)
	gen pro RAGE (receptor pozdních produktů glykace) s genem pro hmyzí luciferázu
	vektor
	PGL3-Basic (Promega, USA)
	dárcovský organismus
	Homo sapiens (gen pro RAGE), Photinus pyralis (gen luc+)
	vložení konstruktu
	nukleofekce do savčích buněk
	signální a selekční marker
	jako signální marker se používá přímo gen luc+ kódující enzym luciferázu
	inzert
	alelická varianta genu RAGE
	vynětí části dědičného materiálu
	ne
	výsledný geneticky modifikovaný organismus
	linie RAGEPGL3B-ENDO742, krátkodobě (24 hodin) exprimující signální gen

ÚDAJE O DÁRCOVSKÉM ORGANISMU, VČETNĚ JEHO PŮVODU

Photinus pyralis : gen luc+ (gen pro enzym luciferázu)

reference : Ow, D. et al. (1986), Science 234, 856.

Homo sapiens : NOS3 (gen pro endoteliální syntázu NO)

reference : Marsden PA, Schappert KT, Chen HS, Flowers M, Sundell CL, Wilcox JN, Lamas S, Michel T. (1992), FEBS Lett., Aug 3; 307(3): 287-93.
původ : DNA banka, Ústav patologické fyziologie, LF MU Brno, ČR

Homo sapiens : RAGE (gen kódující receptor pozdních produktů glykace)

reference : Neeper M, Schmidt AM, Brett J, Yan SD, Wang F, Pan YC, Elliston K, Stern D, Shaw A. (1992, J Biol Chem. 1992 Jul 25; 267(21): 14998-5004.
původ : DNA banka, Ústav patologické fyziologie, LF MU Brno, ČR

ÚDAJE O PŘÍJEMCI A RODIČOVSKÉM ORGANISMU, VČETNĚ JEJICH PŮVODU

H1299: stabilizovaná linie lidských buněk z plicního karcinomu (ATCC CRL 5803) - jedná se o buněčné linie, které jsou standardně užívány v základním výzkumu.
ENDO 742: primokultura, lidské endoteliální buňky z prsní žlázy dospělého jedince - buněčná linie byla získána z University of Dundee, Unit of Celll and Molecular Biology, jenž má vyhrazena autorská práva pro danou tkáňovou kulturu.

ÚDAJE O VEKTORU, VČETNĚ JEHO PŮVODU

PGL3-basic: Promega Corporation, Madison, WI, USA

VÝSLEDEK HODNOCENÍ RIZIKA

Protože charakter donorových organismů a vektory obsahující gen luc+, původem ze světlušky ( Photinus pyralis ), nepředstavují žádné významné riziko, pro hodnocení rizika je rozhodující charakter jednotlivých recipientních buněčných linií:

Linie H1299: Linie lidského plicního karcinomu. ATCC i ECACC řadí linii do kategorie BSL-1.
Reference :
ATCC: www.atcc.org (Search No.CRL5803)
ECACC: www.ecacc.org.uk (Search No.85061113)
Linie ENDO 742: Znesmrtelněná linie lidských endoteliálních buněk z lidské prsní žlázy. Buněčná linie bude získána z University of Dundee, Unit Celll and Molecular Biology, jenž má vyhrazena autorská práva pro danou tkáňovou kulturu. Popsaná buněčná linie je řazena do kategorie BSL-2.
Reference :
O´Hare MJ et al. Conditional immortalization of freshly isolater human mammary fibroblast and endothelial cells. Proc. Natl Acad Sci U S a. 2001. Jan 16; 98(2):642-51

Obecné reference pro stanovení biologického rizika:

American Type Culture Collection: Biosafety Levels
Biosafety in Microbiological a Biomedical Laboratories. (BMBL) 4th Edition (HHS Publication No. (CDC) 93-8395. U.S. Department of Health and Human Services, CEnters for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health; U.S. Government Printing Office: Washington DC; 1999
Health & Safety Executive, UK