K. Kaňková, S. Tschöplová
Cíl:
Srovnání elektroforetogramů izoenzymů LD separovaných v agarózovém gelu ze vzorků normálního séra a sér patologických.
Úvod:
Dehydrogenáza kyseliny mléčné (LD-1 laktát NAD+ oxidoreduktáza, EC.1.1.1.27 ) je enzym, který katalyzuje přeměnu pyruvátu na laktát. Je to enzym, který se vyskytuje v organismu ve formě 5 izoenzymů, lišících se vzájemně fyzikálně-chemickými vlastnostmi. V organismu jsou syntetizovány dvě subjednotky, dva druhy polypeptidových řetězců označených jako H (heart) a M (muscle). Každá molekula LD je tvořena čtyřmi subjednotkami navzájem spojenými vodíkovými můstky. Každá subjednotka má aktivní centrum. Pouze ve spojení všech čtyř subjednotek je molekula aktivní. Jednotlivé izoenzymy jsou tvořeny některou z kombinací těchto subjednotek.
LD-1 HHHH LD-2 HHHM LD-3 HHMM LD-4 HMMM LD-5 MMMM
Subjednotky M jsou syntetizovány zejména ve tkáních s anaerobním metabolismem, naproti tomu H subjednotky ve tkáních s aerobním metabolismem. Izoenzymy LD s převahou subjednotek H (LD-1 a LD-2) jsou proto předurčeny katalyzovat přeměnu laktátu na pyruvát ve tkáních s aerobním metabolismem (myokard, mozek, ledviny, erytrocyty, trombocyty a leukocyty). Izoenzymy LD s převahou subjednotek M (LD-4 a LD-5) katalyzují především přeměnu pyruvátu na laktát ve tkáních s vysokou úrovní anaerobní glykolýzy (kosterní svalstvo, játra). U pacientů s infarktem myokardu a chronickou hepatopatií je stanovení izoenzymů LD diagnosticky významné.
Při elektroforetickém stanovení izoenzymů LD se využívá rozdíleného náboje jednotlivých forem LD. Izoenzymy LD-1 nesou v alkalickém prostředí největší záporný náboj a proto putují k anodě nejrychleji, izoenzymy LD-2, 3 a 4 postupně nesou menší náboje a putují tedy pomaleji. LD-5 nese nejmenší náboj, má nejmenší pohyblivost a putuje gelem nejpomaleji.
Po elektroforetickém rozdělení se jednotlivé izoenzymy LD dají lokalizovat díky své schopnosti katalyzovat redukci bezbarvého indikátoru na barevnou formu. Pruhy náležející jednotlivým izoenzymům jsou patrny pouhým okem a jejich intenzita se může měřit registračním fotometrem.
Při fotometrickém vyhodnocování - denzitometrii se graficky zaznamenává změna intenzity zabarvení agarózového gelu. Každý barevný pruh na gelu odpovídá jednomu izoenzymu LD, vytvoří na záznamu vrchol křivky. V přítomnosti všech pěti izoenzymů LD se vytvoří pětivrcholová křivka. Velikost plochy pod jednotlivými vrcholy křivky je úměrná relativnímu množství jednotlivých isoenzymů LD.
Stanovení izoenzymů LD je nejvíce využíváno při diagnostice infarktu myokardu a jaterního poškození. U infarktu myokardu se z ischemického ložiska uvolňují izoenzymy LD-1 a LD-2, a to 25 až 48 hodin po začátku koronární příhody a dosahují maxima 3. až 4. den. Poměr isoenzymů LD-1 a LD-2 je roven 1 nebo >1.
Stanovení izoenzymů LD je diagnosticky cenné pro odlišení infarktu myokardu od plicní embolie. Izoenzym LD-5 má vztah k jaterní tkáni a bývá zvýšen u jaterních lézí. U chronických hepatopatií bývá vedle zvýšené hladiny LD-5 zvýšena také hladina LD-4. Zdá se, že LD-5 je obsažen v jaterním parenchymu, kdežto LD-4 spíše v elementech mezenchymu.
Materiál:
skleněná podložní sklíčka (7,6 x 2,6 cm), elektroforetická vana, el. zdroj, termostat, automatická pipeta a špičky, vzorky séra
Roztoky:
Barbitalový pufr:
Barbitalum solubile 10,3 g
Kyselina dietylbarbiturová 1,84 g
Aqua destilata ad 1000 ml
Barvící roztok:
Redukovaný substrát (laktát)
Koenzym NAD+
Oxidované barvivo (NBT)
Přenašeč elektronů mezi NADH a barvivem (fenazinmethosulfát)
Pufr o pH 8,6 a aktivující ionty
Provedení:
· Na očištěná skleněná podložní mikroskopická sklíčka nalijeme na nivelizačním stolku 1 % agarózový roztok a necháme ztuhnout.
· Na takto popsaná sklíčka nanášíme analyzované vzorky séra (10 ml) pomocí hrany filtračního papíru a necháme asi 10 min difundovat do agarózy. Na každé sklíčko nanášíme 2 vzorky.
· Po 10 minutách povrch gelu opláchneme destilovanou vodou a vložíme do elektroforetické aparatury. Sklíčka s gelem spojíme s barbitalovým pufrem pomocí proužků filtračního papíru, uzavřeme aparaturu, spojíme se zdrojem a dělíme za následujících podmínek
· ( U = 200 V, I = cca 32 mA, t = 55 min, T = 10°C).
· Po ukončení elektroforetického dělení vložíme sklíčka agarózovou vrstvou dolů do Petriho misek (3 sklíčka/misku) a opatrně podlejeme inkubačním roztokem. Barvíme 45 min při 37°C. Po obarvení vložíme na 30 min do vypírací lázně a poté vysušíme.
· Pomocí programu TotalLab od firmy Nonlinear Dynamics nainstalovaného v demo režimu stanovte poměr jednotlivých izoenzymů LDH ve zkoumaném vzorku séra. Fotografie gelů ve formátu TIF (256 stupňů šedé)
Protokol:
Výsledky elektroforetické separace zaznamenáme do protokolu (spolu se výsledky měření programem TotalLab). Popíšeme rozdíly mezi spektrem isoenzymů LD z normálního a patologického séra a interpretujeme je.