Laboratoř dědičných poruch metabolismu OKB - PDM

V laboratoři DPM se provádí selektivní metabolický screenig – analýza plazmy, séra, moči u klinicky vybraných pacientů. Screening zahrnuje vyšetření aminokyselin, sacharidů, organických kyselin, purinů, pyrimidinů a dalších látek Součástí vyšetření je i biochemická interpretace nálezů.
Z laboratorních technik se v laboratoři DPM používají hlavně chromatografické metody (chromatografie papírová, tenkovrstvá, kapalinová, iontoměničová, plynová) s různými typy detekce (UV-VIS, diode array, hmotnostní spektrometrie).

Papírová chromatografie se používá pro orientační „screening“ aminokyselin v moči. Aminokyseliny jsou rozděleny na papíře Whatmann, detegovány ninhydrinem a chromatogram je hodnocen vizuálně.

Tenkovrstvá chromatografie slouží pro semikvantitativní analýzu sacharidů v plazmě, séru, moči. Mono-, di- a oligosacharidy jsou rozděleny na vrstvě silikagelu, detegovány naftoresorcinolem a hodnocení je opět vizuální.

Ionexová chromatografie:
Kvantitativní stanovení aminokyselin v séru, plazmě, moči se provádí na automatickém analyzátoru aminokyselin Biochrom 20 (Pharmacia), který pracuje na principu ionexové chromatografie. Pro chromatografickou analýzu se používá supernatant po deproteinaci plazmy nebo séra kyselinou sulfosalicylovou, moč se používá nativní, pouze s úpravou pH. Aminokyseliny jsou rozděleny na ionexové koloně analyzátoru podle své kyselosti, eluát z kolony je v hydraulickém obvodu analyzátoru smísen s detekčním činidlem ninhydrinem (postkolonová derivatizace) a vzniklé zbarvení je proměřováno fotometrem. Výsledek je zobrazen v podobě chromatogramu, kvantifikace probíhá metodou vnitřního standardu.

Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií se využívá pro semikvantitativní analýzu organických kyselin v moči. Organické látky z moči jsou nejdříve vyextrahovány do organického rozpouštědla, rozpouštědlo je z roztoku odpařeno pod proudem dusíku a odparek je poté podroben chemické derivatizaci, aby bylo možno organické látky převést do plynné fáze. Analýza se provádí na plynovém chromatografu s hmotnostním spektrometrem (Agilent). Organické látky jsou rozděleny na kapilární koloně a záznam z hmotnostního detektoru je zobrazen jako chromatogram. Software umožňuje porovnání získaných hmotnostních spekter analyzovaných látek s databází spekter uloženou v PC a tím jejich identifikaci.

Kapalinová chromatografie na reverzní fázi (nepolární stacionární fáze a polární mobilní fáze): Laboratoř DPM je vybavena separačním modulem Alliance (Waters) s diode-array detektorem. Přístroj se používá pro řadu analýz:
Analýza purinů a pyrimidinů se provádí z nativní, pouze mírně upravené moči.
Vyšetření 7-dehydrocholesterolu (markeru syndromu Smith-Lemni-Opitz) se provádí po extrakci z biologického materiálu, kterým je nejčastěji plodová voda.
Pro monitorování pacientů s fenylketonurií / hyperfenylalaninémií slouží stanovení fenylalaninu a tyrozinu z plazmy či suché krevní skvrny (po deproteinaci materiálu resp. vylouhování materiálu metanolem a po předkolonové derivatizaci).
Kapalinový chromatograf slouží i pro analýzy, které bezprostředně nesouvisí s problematikou DPM – stanovení kys.benzoové a hippurové v séru a v moči (pro posouzení toxických účinků chemické nekrektomie u pacientů s popáleninami), stanovení aktivity enzymu thiopurinmethyltransferázy (posouzení toxicity thiopurinových cytostatik u onkologických pacientů).

V rámci diagnostiky cystické fibrózy se v laboratoři DPM provádí stanovení chloridů v potu na analyzátoru chloridů Sherwood 926S. Analyzátor chloridů je coulometr, umožňující velmi citlivé stanovení chloridových iontů ve zředěném roztoku, jakým je výluh z odběrového papírku na potní test.

K vybavení laboratoře patří UV-VIS spektrofotometr Lambda 20 (Perkin-Elmer), který slouží pro kvantitativní stanovení glykosaminoglykanů v moči („zkumavková“ reakce s barevným činidlem) a kyseliny orotové v moči (jako markeru deficitu ornitin-karbamoyltransferázy; po izolaci z moči a chemické derivatizaci).