Designované a syntetizované geny kódující nově zkonstruované proteinové katalyzátory (luciferázy) s ověřenými vlastnostmi

Varování

Publikace nespadá pod Lékařskou fakultu, ale pod Přírodovědeckou fakultu. Oficiální stránka publikace je na webu muni.cz.

Autoři

MAREK Martin DAMBORSKÝ Jiří BEDNÁŘ David PLUSKAL Daniel MAJEROVÁ Marika PLANAS IGLESIAS Joan

Rok publikování 2021
Druh Technicky realizované výsledky (prototyp, funkční vzorek)
Fakulta / Pracoviště MU

Přírodovědecká fakulta

Popis V rámci dosavadního průběhu projektu se podařilo výpočetně navrhnout novou sadu syntetických koelenterazin-závislých luciferáz, označených jako AncFT9 až AncFT16. Za tímto účelem byl použit nově vytvořený algoritmus, který je postupně implementován do nového softwarového nástroje LoopGrafter, a který je momentálně vyvíjen a testován v Loschmidtových laboratořích. Výpočetní návrh byl proveden na proteinovém templátu termostabilního domnělého předka luciferázy RLuc z Renily fialové (Renilla reniformis). Tento domnělý předek byl navržen v naší laboratoři (Chaloupkova et al., 2019). Výpočetním algoritmem implementovaným v programu LoopGrafter jsme nyní do tohoto předka transplantovali různé kombinace proteinových smyček lemujících aktivní místo enzymu, které jsme v našich předešlých experimentech objevili jako klíčové pro zesílení luciferázové funkce v tomto proteinovém foldu (Schenkmayerova et al., 2021). Tímto postupem vznikla nová sada syntetických luciferáz (AncFT9 až AncFT16). Geny kódující navržené luciferázy byly výpočetně optimalizovány pro rekombinantní produkci v Escherichia coli, a následně byla provedena jejich syntéza a klonování do expresního plasmidu pET21b. Na 3´-konec genů byla vložena sekvence kódující hexahistidinovou kotvu pro usnadnění afinitní purifikace rekombinantních enzymů. Geny byly vloženy pod kontrolu indukovatelného promotoru T7. Expresní testy v malém měřítku ukázaly, že všechny nově zkonstruované syntetické luciferázy se produkují jako solubilní proteiny v E. coli. Z expresních testů je evidentní (Obrázek 1), že rozpustnost nově designovaných luciferáz je výrazně vyšší než rozpustnost stabilizované luciferázy z Renily fialové (RLuc8). Vysoká expresibilita a rozpustnost rekombinantních luciferáz jsou klíčové parametry pro jejich aplikační využití jako reportérové bioluminiscenční enzymy. Tři nově zkonstruované luciferázy (AncFT9, AncFT15 a AncFT16) byly vybrány pro detailní biochemickou charakterizaci. Rekombinantní produkce těchto luciferáz ve velkém měřítku ukázala, že je možné získat až desítky miligramů těchto luciferáz z 1 L buněčné kultury E. coli (Obrázek 2). Teplotní stability produkovaných luciferáz byly měřeny pomocí diferenciální skenovací fluorimetrie a jsou uvedeny v grafické příloze (Obrázek 3). Měření koelenterazin-závislé luciferázové aktivity prokázala, že nově zkonstruované luciferázy jsou plně funkční, generují modré světlo, a jejich enzymatická aktivita je prokazatelně vyšší než aktivita předešle zkonstruovaného prototypu AncFT (Tabulka 1).
Související projekty:

Používáte starou verzi internetového prohlížeče. Doporučujeme aktualizovat Váš prohlížeč na nejnovější verzi.

Další info