| Popis |
ÚVOD Výhodou chemických opatření v ochraně rostlin je, že v krátké době můžeme moderními stroji ošetřit velké plochy, což umožňuje vykonat potřebné zákroky včas, tj. tehdy, kdy porosty nejvíce ohrožují houbové choroby, hmyz a jiní škůdci. Výraznou předností chemických metod ochrany zemědělských plodin je většinou velmi jednoduchý a poměrně levný způsob aplikace přípravku. Používání chemických sloučenin však přináší také celou řadu problémů. Například chlorované pesticidy, jako například deriváty DDT, hexachlorbenzenu a řada dalších byly velmi hojně užívány v ochraně rostlin a nyní je známo, že rezidua těchto pesticidů se v živočišném i lidském organismu ukládají do tukové tkáně, a z ní mohou přecházet do vajec ptáků nebo mateřského mléka savců. Navíc ve větších koncentracích pak mohou způsobovat nádorová onemocnění či neplodnost. Proto je potřebné vyvíjet jednoduché a přesné nástroje k detekci takových pesticidů. Cílem naší práce bylo vyvinout biosensor pro stanovení chlorovaných pesticidů. VÝSLEDKY A DISKUSE V naší práci jsme studovali základní chování chloridů na uhlíkových elektrodách (CPE, GCE). Signál chloridů byl ovlivňován složením základního elektrolytu, a proto jsme testovali vliv rozdílných pufrů (acetátový, fosfátový a borátový). Zjistili jsme, že nejvyšší odezvy chloridů byly pozorovány v acetátovém pufru. Navíc jsme studovali vliv různého pH acetátového pufru při pH 5. Za nejoptimálnějších podmínek byla poté studována závislost na koncentraci s limitem detekce kolem 10-6 M. Protože v životním prostředí je koncentrace chlorovaných uhlovodíků velmi nízká, výrazně nižší než výše uvedený limit detekce, bylo nutno přistoupit k navržení nového postupu s cílem zvýšit senzitivitu. Z proto jsme navrhli unikátní postup u kterého využíváme interakce mezi: Ag+ a Cl- (Ag+ + Cl- => AgCl sraženina). Uhlíkovou pastovou elektrodu jsme modifikovali přídavkem AgNO3. Díky této modifikaci se podařilo snížit limit detekce chloridů na jednotky nanomolární koncentrace (10-9 M). Navíc, abychom byli schopni detekovat chloridy z halogen uhlovodíku (pesticidu), musí být halogen uvolněn z uhlovodíku. Byla popsána řada druhů chemotrofních bakterií obsahujících enzymy štěpící takové vazby. Některé z těchto baktérií byly izolovány Loschmidtově laboratoři. Proto bylo možné využít enzymu dehalogenázy z bakterie Pseudomonas paucimobilis, která chlorid uvolní z uhlovodíku. Takto uvolněný chlorid je možné analyzovat námi vypracovanou elektroanalytickou metodikou. Je známo, že aktivita enzymu je ovlivněna řadou faktorů, jako je složení pufru, jeho pH, iontovou silou a teplotou. Nejdříve byly testovány běžně používané podmínky enzymového štěpení využívající glycinový pufr. Z našich výsledků však bylo zřejmé, že složky glycinového pufru (pravděpodobně díky povrchové aktivitě glycinu) ruší elektrochemické stanovení chloridů. Proto bylo potřebné modifikovat prostředí enzymové reakce. Porovnali jsme tři pufrovaná prostředí (glycinový, fosfátový a borátový pufr). Chloridy bylo možné detekovat v prostředí fosfátového pufru (pH = 7,55), ale ještě mnohem lépe v prostředí pufru borátového (pH = 7,6), vzestup signálu asi o 30%. V borátovém pufru enzym štěpil halogenuhlovodík asi o 30% méně v porovnání s glycinovým pufrem. Tento kompromis nám umožnil sledovat štěpení modelového chlorovaného uhlovodíku (1-chlorhexan) enzymem dehalogenázou. ZÁVĚR Analýza chloridů je v současné době možná jen pomocí zdlouhavých laboratorních málo senzitivních metod. Proto jsme navrhli nový postup pro sledování chlorovaných uhlovodíků za pomoci elektrochemie v kombinaci s bakteriálním enzymem.
|