| Popis |
Interakce mezi B lymfocyty a jejich životním mikroprostředím (tvořené buněčnou složkou a extracelulární matrix) v lymfatické tkáni jsou kritické pro přežívání normálních i maligních B lymfocytů. Uvedené interakce jsou zprostředkovány převážně prostřednictvím integrinových receptorů. Integriny jsou heterodimery složené z podjednotek alfa a beta. B lymfocyty na svém povrchu exprimují především alfa4beta1, alfa5beta1, alfa6beta1, alfavbeta1 integriny. Jejich aktivací dochází k rozdílným buněčným dějům. Nejvýznamnějším je záchrana B lymfocytů od fyziologicky navozené i chemoterapeutiky indukované apoptózy (Sarkar et al 2002 et Astier et al 2003). Vzhledem k nejasnosti mechanismu, kterým integrinové receptory zabraňují apoptóze leukemických B lymfocytů, provedli jsme srovnání profilů genové exprese v různých časových intervalech od aktivace beta1 integrinů specifickým ligandem (fibronectin) versus negativní kontrola. Za tímto účelem jsme použili technologie DNA čipů (microarrays), nesoucích na svém povrchu sondy pro přibližně 10.000 lidských genů (Svoboda et al. 2004). Apoptóza v experimentu byla indukována odstraněním růstových faktorů z kultivačního média. Výsledkem byla identifikace 38 genů, rozdílně exprimovaných za uvedených podmínek, z nichž 13 jsme podrobili další validaci, a to buď pomocí RealTime Quantitative PCR nebo přímo na proteinové úrovni. U 11 ze 13 genů byla validita potvrzena. Jednalo se o geny zahrnuté v procesech: adheze (VAV2, EPB41L1, CORO1A), proliferace (FRAP1, CCT4), intracelulární komunikace (GJB3) a apoptózy (FBI1, CD79a, REQUIEM, cFOS a Caspase 7) (Astier et al. 2003). V dalších experimentech jsme se zaměřili na Caspase 7, jako přímého exekutora apoptózy. Prokázali jsme začlenění Caspase 3 a caspase inhibitorů XIAP, IAP, Survivin do procesu inhibice apoptózy indukovaného aktivací integrinových receptorů (Astier et al. 2004). Během přednášky budeme stručně prezentovat experiment, ve kterém se nám pomocí DNA čipů podařilo na modelu lidských B lymfoblastů identifikovat geny spjaté s adhezí a aktivací integrinové signální dráhy. Vzhledem k tomu, že se jedná o modelový experiment pro využití DNA čipů ke studiu jakékoliv receptorové signální dráhy, zaměříme diskusi na jednotlivé kroky procesu jeho přípravy, realizace a vyhodnocení (Svoboda et al. 2004). Jedním z cílů bude upozornit na možná úskalí a rizika DNA čipových analýz, neboť až do současnosti neexistovala pravidla jejich standardizace, ani závazná doporučení stran biostatistického zpracování miliónů datových položek z těchto analýz vzešlých. Biostatistické zpracování dat je přitom klíčovým bodem experimentu a jeho interpretace (Stoeckert et al. 2002). I přesto, že základní dogma informačního toku v biologických systémech (DNA-RNA-protein-fenotyp) dává předpoklad k tomu, že biologické koreláty genové exprese jsou pomocí DNA čipů identifikovatelné, je potřeba mít při interpretaci těchto dat na paměti, že jsou zatíženy především falešně pozitivními výsledky, že popisují pouze jeden stupeň informačního toku, a tak nemohou plně postihnout post-transkripční a post-translační děje, proteinové interakce a komplexní in-vivo podmínky (Duggan et al. 1999).
|